ascnit variedades: 01/02/09

Preparo do meio de cultura “ágar-batatas”

Igredientes para preparar 500ml de Ágar-batatas:

-batata inglesa ou batata-doce (1/2 kilo), descascadas ou só picadas (podendo ser só cascas cruas, ½ kilo) ,

-água mineral, ou de poço, ou de chuva, coletada das calhas (sem cloro) 2 litros,

-ágar em pó 4g (pode ser kanten= ágar comestível vendido em lojas de produtos orientais = é mais barato que ágar-laboratorial = porque para cultivo de esporos de cogumelos não necessita tanta purificação), (existe kanten em folhas ou em bastão esponjoso, que servem igual também, e quando em bastão, tem que pesar antes que ele vem em pedaços grandes nas cores incolor ou vermelha);
-açúcar (1/2 colher de sopa) (obs.: nunca use mel de abelhas, porque tem anticorpos que não deixam crescer os esporos) (pode usar glucose de milho ou melado de cana-de-açúcar) ;

Obs.: Se usar açúcares = glicídios (glucose, dextrose, frutose, açúcar de cozinha,...), os esporos tenderão a se multiplicar em células globulosas (placa-leitosa-parda) de cogumelos , se acomodando. Se quizer ter mais chance de formar hifas brancas (micélio) evite açucarar (para ter menos glicose), assim os esporos vão tentar trabalhar mais, para buscar comida mais longe. Pode aumentar, neste caso, substâncias com mais peptonas, como feijão, soja, caldo de carnes(frango,gado,peixe,....);
_________________________________________________________________

Exemplo + comum de acontecer, quando se coloca quaquer tipo de açúcares. (glucose,dextrose,frutose,...melado,...açúcar de cozinha). O vegetal que usar batata ou bananas,.... já têm glicoses suficientes para os esporos e não precisa acrescenter mais nada.

Na foto os esporos do cogumelo crescem em forma de células globulosas ( em placa-leitosa-parda) sobre o gel.

Neste exemplo mostrado, no frasco à esquerda, nota-se também que a coloração avermelhada, do gel desaparesceu e ficou parda clara, e sobre ele, na superfície uma "gosma" ou "placa" leitosa parda. Cada gota dessa gosma têm milhões de células globulosas do cogumelo, e não são bactérias, que muito pode se confundir.
O frasco à direita é de controle visual. É um frasco virgem, ou seja, sem inoculação de nada, para mostrar a diferença de cor que fica, na esquerda.
Se nada crescer, como quando, haste metálica de inoculação estava muito quente ainda, a cor do gel permanecerá inalterada (=avermelhada =corante alimentício para confeiteiro).
____________________________________________________________

Exemplo raro no mundo dos fungos:

No frasco maior está um cultivo de fungo do formigueiro(saúvas).

Note-se que o gel, pemance avermelhado e só escureceu um pouco, mesmo depois de 17 semanas em temperatura ambiente. Só ficou 1 semana ( a 1ª) na incubadora. Significa que ela não libera, quaze nada de ácidos.

___________________________________________________________

Este foto mostra um exemplo de cultura de tecido de cogumelo. O objeto preto em cima do gel é pedaço de cogumelo, picotado, após flambagem, para extair dele esporos. Normalmente pedaços de tecidos ficam pretos e varia conforme espécie. Nesta espécie (nativo achado do mato), o escurescimento, pode ser algo normal, característico dele, próprio).

O escurescimento assim ocorre normal(em cultura de tecido) em espécies como: Shiitaque(lentinus edodes), Agaricus campestris(Champignon pariz), Portobello(Agaricus bisporus=agaricus marrom), Boletus luteus, Boletus edulis,...

Trasfira somente um pequeno pedaço da hifa mais clara, com arame flambado, para próxima cultura. As próximas não devem escurescer. O escurescimento na 1ª cultura de tecido, vem dos componentes que tem dentro do tecido do cogumelo, por "osmose".

Se o escurescimento iniciar longe do tecido de cogumelo, considere como contaminante.

O que não costuma acontecer com Pleurothus ostreatus (hiratakes e shimejis), Auricularia auriculatas, Enokitake-branco,...Que permacem no máximo, gel de cor parda clara.
Note, também, que o gel escureceu muito. Mas há uma grande quantidade de gosma parda(placa de glóbulares de esporos deste cogumelo). E a placa não tem pontos de coloração diferentes. Isso é indício de que não houve contaminação. Para re-semear é só tocar na gosma parda com ponta de arame flambado e inocular na cultura seguinte de gel. E observar se ficará a mesma gosma(placa) parda clara. Depois da segunda inoculação não sair hifas brancas, tente todas as técnicas para fazer brotar hifas, principalmente com spawn. Só depois disso, se nada funcionar despreze estas amostras, e iniciar tudo de novo.

________________________________________________________

Nesta foto, o frasco à direita, não mudou sua coloração, nem formou placa de gosma na superfície, mesmo depois de 16 semanas(1º na incubadora e restante na temperatura ambiente). Significa que nada estava vivo quando inoculou.
O frasco em preto, à esquerda está com contaminação avançada, provávelmente por aspegilus sp. escuresceu muito, quer dizer muitos ácidos e com 16 semanas assim, o esporo do cogumelo, mesmo tenha morrido por causa dos ácidos.
O frasco no meio, atrás das duas é para controle da foto. É frasco virgem, sem inoculantes.
O que está mais vermelho, na direita é quantidade maior de corante que foi usado, nesta leva de frascos.
_____________________________________

Opcional:

-amido de milho ou mandioca (polvilho doce, e não polvilho azedo) 1 colher de sopa, pode ser acrescentado ao gel, sem problemas.
-sal de cozinha (1/2 g) metade de um sache ( se estiver usando água de chuva=das calhas), ou se o cugumelo é nativa de áreas litorâneas ou de região com terreno mais salino.
- 5 à 10 gotas de corante alimentício (vermelho ) ajuda identificação de crescimento, pela mudança de cor durante crescimento, (pela liberação de ácidos como: ác.acético, ác.láctico, ác. clorídrico,... e se nada crescer a cor permanecerá avermelhada e inalterada ),

______________________________________________

Modo de preparo(p/ 500 ml de ágar/gel):

Numa panela de pressão, junte batatas (1/2 Kilo), mais 1 litro de água e cozinhe chiando por 10 min., ou em panela normal 20 min.
Coe o caldo de batatas (a parte líquida é que vai ser utilizada).
Meça 500 ml, se faltar complete com restante que sobrou de água, até os 500ml.
Coloque numa panelinha ou caneco e acrescente os outros ingredientes(ágar 4g e 3 gotas de corante alimentício) e torne ao fogo, mexendo sempre até dissolver todo ágar e cozido o amido.

Obs.: As batatas podem ser substituídas em igual quantidade, de: abóboras (qualquer tipo desde que maduras), ou bananas (pode ser passados do ponto, ou só cascas).

Ainda quente (antes de endurecer) envase as vidrarias onde serão cultivadas. Uma seringa grande(10 ou 20 ml sem agulha) auxiliará a envasar vidrinhos pequenos.

_____________________________________________________________

Envasando vidrinhos (frasco-ampôla = de remédio sem tampa de borracha) com gel para cultura.

Não precisa comprar tubos de ensaio ou Placas de petry, que são caras.

Pedir frascos ampôlas (usadas) em hospitais e farmácias (gratuítamente) . Deixe os vidrinhos de molho em desinfetante (por exemplo hipoclorito de sódio [ alvejante] por 24 horas) antes de começar a lavar. Abra lacres de alumínio com alicate de ponta ou tesourinha de ponta, com cuidado para não se ferir. Use luvas grossas para proteger as mãos de corte se quizer. Faça uma escovinha, amarrando pedacinho de palha de aço ou esponja na ponta de arame ou palito de churrasquinho. Pode usar mini-escovinha de dente, amarrado na ponta de outro arame mais grosso (20cm x 1 mm) + ou -. Ou, compre escovinhas para tubo de ensaio em lojas de artigo médico ou laboratorial ou dentárias.

Obs.: Tampinhas de borracha não se usa mais! Preferível camada tripla (1ª de pedaço de saco plástico, 2ª de folha de alumínio, 3ª de pedaço de saco plástico), e prender com atilho (argola borrachinha). Porque, com tampa de borracha, forma pressão interna com formação de CO2 e metano à medida que os esporos forem crescendo, e sob alta pressão a tampa voa e contamina, ou se prender com plástico, os esporos param de crescer. Sendo de plástico, na vistoria diária, se ver algum muito estufado, é só abrir um pouco, pelos lados, tirar o ar excedente e fechar imediatamente, de novo e prender com atilho (argola de borrachinha) novamente. O saco plástico é do tipo termo-resistente, aquela para micro-ondas/freezer (o transparente do supermercado para legumes e frutas à granel = plástico propileno) que agüenta temperatura do autoclave ou panela de pressão.

_______________________________________________________

Escorra bem os frascos, emborcado sobre uma toalha, antes de começar a envasar com gel de cultura, para não ficar excesso de água, dentro.

Recortes de saco plástico(propileno e não de vinil) + folhas de alumínio para tampar vidrinhos de cultura/gel. Folha de alumínio deve ficar entre duas de plástico, porque os de alumínio corroe fácil e abre cheio de buraquinhos durante crecimento. A folha de alumínio só ajuda durante esterelização, quando o plástico se estica com calor e pressão interna e pode abrir furo. Se tiver alumínio o plástico não se estica tanto, permanece quaze igual a antes da auroclavagem.
E se for só alumínio, ela também se rasga fácil, quando tenta abrir frasco, para inocular.

Tampar frasco com as tampas de borrachinhas de quando vieram juntos, não foi uma boa idéia, porque na hora de esterilizar, todos pulam fora, e depois durante cultivo também. E se prendê-las com folhas plásticos e argola de borracha, ficam uma pressão interna grande, dentro e os esporos param de crescer ou morrem.

Se deixar só folhas de plásticos como tampa, segurando com atilhos (argolas de borrachinhas), dá para ficar visualizando, quando ela fica muito estufado. Então, é só abrir um pouco pelos lados e voltar a prender com argolinha(atilho), sem contaminar por dentro.
__________________________________________________________

Para esterilização em panela de pressão:

Use uma tampa velha (de panela) e fure-os ou pegue uma tela metálica. Como precisa ficar de 2 cm a 3 cm acima, para não mergulhar material na água, tem que ter pezinhos ou coloque 3 latinas vazias de sardinha no fundo, mais 3 tampas metálicas de conservas.

Latinhas vazias de sardinhas e atum + tampas de conserva metálicas no fundo, para servirem como pés. As tampas metálicas, fazem barulhos, durante a fervura, e quando secar água, irá deixar de ouvir esse barulho. Com tempo vai saber exatamente, quanto de água colocar, para secar exatamente aos 30 min de chiado. Ideal para secarem o material no ponto. (Estou usando panela de pressão de 25 Litros, coloco 500 ml e o fogo é boca grande à gás , em fogareiro de chão para caldeirão)

Depois da esterilização: Os pacotinhos (kits etc...) precisam ir em local seco e quente, para secarem bem. Já os vidros com gel de cultura precisam (principalmente os vidrinhos pequenos e ou tubos de ensaio) em superfície inclinada à +ou- 45º G.
Por isso, os frasquinhos dentro de uma caixa metálica como quentinha(marmita) é bem util.
É só pegar a caixa, ainda quente e levar para um local (bancada) e calçar um objeto por baixo, de só um dos lados, para que o gel endureça inclinado.

Se esqueceu na panela e já endureceu o gel, é só esquentar um pouco no microndas. Vá esquentando em etapas de 10 segundos cada, até chegar a ser líquido novamente. E coloque os frasquinhos em posição semi-deitadas.

Porque do gel inclinado?
É porque se durante a incubação da cultura, formar líquidos de condensação nos lados do vidro, irá escorrer para fundo inclinado e não afogará totalmente as hifas (micélio) dos cogumelos. Se ficarem muito encharcados, as hifas tendem a crescer só em glóbulos e não em prolongamentos (pelinhos brancos=hifas/micélio).
Não que isso seja ruim, mas dificulta saber se aquelas colônias globulares são do cogumelo em questão, ou de algum contaminante de bactérias, se não tiver boa bagagem de prática e experiência. E ainda com um auxílio de bom microscópio.

Ponha os frasco após esterilizado, ainda quentes semi-deitadas, para o ágar endurescer inclinado.

____________________________________________________________

[Quando aparecer contaminante, se ficarem + ou – afastados, uma colônia da outra, podemos escolher só aquela colônia de hifas brancas (tocando com arame, somente nela) para semear um novo frasco de cultura, a fim de ter colônia pura, só daquele cogumelo que se quer. Isso facilitaria.
À isto, se chama técnica de isolamento e purificação de colônias. É escolher a colõnia que interessa e re-inocular no novo frasco, antes que os contaminantes creçam muito e ocupe todo espaço da cultura.Por isso tem que olhar todos os dias. Assim que surgir contaminante, passe imediatamente para geladeira e assim que der tempo de praparar nova leva de frasco com gel, re-semeie novamente, retirando do contaminado, sem tocar na colônia invasora. Se a cultura estiver numa Placa de petry, cauterize só o invasor, encostando um objeto metálico (bisturi ou colher de café amarrado em palito de churrasquinho) bem quente, quase em brasa. As vezes funciona, mas quando abre, pode estar correndo risco de outra contaminação. Então aproveite o mesmo momento para tirar amostra do esporo interessado, para inocular novos frascos, para ter mais amostras no futuro, só por garantia de perpetuação]

Se mesmo sendo uma colônia de glóbulos, daquele cogumelo que se quer, se estiverem mais ou menos afastados da outra contaminante, podemos fazer o mesmo processo ( de separar, isolar)
Se estiver encharcado de mais e tudo nadando, não poderíamos identificar, qual é quem, ou em algumas vezes se houve ou não contaminação, por alguns serem muito parecidos uma da outra.

Coloque água cerca 2 ou 2,5 cm de altura no fundo da panela de pressão.

Toda vidraria que contiver gel de cultura precisa ser colocado em pé, para não vasar.
Coloque por cima outros matérias que podem ficar deitadas, e se forem pacotinhos pequenos, coloque dentro de um saco plástico termo-resistente (tipo freezer/microondas) e aberto, como mostrado na figura.

Vidrarias com gel, colocar primeiro, no fundo, em pé.

Se deixar pacotinhos pequenos, à solta dentro, poderá cair pelos lados e se encharcar na água. Se estivar mergulhado na água a temperatura naquele trecho, não irá passar dos 100ºC. E se ficar só no vapor, sob pressão atingirá os 120ºC, ideal para esterilização.

Certo.
Saco plástico, com pacotinhos aberto, para ter contato com vapor quente.

Errado
Pacotinhos colocados soltos, pode cair pelos lados para dentro da água do fundo.

Tempo de esterilisação = 30 minutos chiando. Deixe esfriar ao natural para aproveitar bem o calor na panela e economizar gás.
Isto aqui é só para cogumelos e não para cirurgias ou curativos.

Os francos com meio de cultura, é preferível tampar em tripla camada ( a 1ª com plástico, 2º com alumínio-folha e 3º com plástico), porque na hora de abrir o frasco, a folha de alumínio costuma estar grudado e rasga facilmente. Então, ao abrir, sempre vá puxando com cuidado para cima, pegando pela 1º camada de plástico . E não abra removendo completamente a tampa. Abra somente o necessário (espaço), para introduzir ponta de arame para inocular (semear esporo).

Frasquinhos envasados e tampados, prontos para serem esterilizadas. Observe que o gel não deve conter espumas ou gorduras na superfície, para não cunfundir visualização durante crescimento.

Obs.: Reforçando um detalhe, é de que nem sempre ou em maioria das vezes os esporos de cogumelos, crescem em formato de colônias de glóbulos (quando acrescidas de compostos glicosados=glicídios), semelhante às das bactérias.
Claro que se começar de primeira, a crescer em formato de hifas brancas (micélio), facilita em muito a identificação, e separá-lo dos contaminantes, mesmo à olho nu, porque se faz segunda cultura só re-semeando aquela colônia de micélios brancos.
Mas imensa maioria das vezes começa crescendo em colônia globulares e não hifas/micélio(células mais alongadas e brotando uma depois a outra, formando fila comprida (tecido especializado para buscar alimento em locais mais distantes ou frutificar um cogumelo), dependendo de como preparou mistura do gel.
Por isso se de imediato parecer que não deu esporo do cogumelo, naquela cultura, não se engane. Se não escurecer, mantenha ele incubando, e observe diariamente. Se dentro de 2 semanas não aparecerem hifas brancas, pegue o mesma amostra, para inocular um novo frasco de cultura. Se mesmo assim, não aparecerem hifas brancas, dê um choque térmico (colocando 24 horas na geladeira = na porta, em baixo).
Se não funcionar, mesmo assim, coloque-o em cultura de Spawn (composto em grãos ou fibra vegetal(serragem, fibra-de-trigo ou casca-de-arroz) mais farinha de algum ceral(milho,trigo,... )Fazendo em frasco pequeno como um copo-de vidro ou vidro de maionese, etc...ou pote de plástico termo-resistente (que aguente temperatura da esterilização).
Cultura de Spawn falaremos mais à parte, mais adiante.
Geralmente os mais difíceis, aparecem colônia de hifas(micélio branco) só num substrato, onde ele tem de se esforçar, mais para conseguir alimento. E a vida no gel, é vida boa demais para ele, e fica acomodado.

_________________________________________

Exemplo de esporo de cogumelos em forma globular( ou forma cocos oval com células individualmente separadas umas das outras) e não em hifas.

Imagem deアカキツネガサ=Akakitsunegasa(Leucoagaricus rubrotinctus). Esta imagem foi copiada da internet.
Dependendo das espécies, esse tipo de esporos tem formas como uma vírgula e ortros como uma letra em "y". Podem ter coloração variada também conforme cada espécie. É bom procurar na internet, imagens de esporos, para espécie.
Existe também diferenças entre esporo de célula somática(2n), para uma célula gameta(1n).Tamanho e formato, bem como coloração pode variar em cada um destes estados físicos , de um mesmo cogumelo.
Pode aida variar conforme estado de desidratação ("esporos verdadeiros"). Neste estado, são menores, alongados ou esféricos, com um ou dois núcleos (conforme espécie). Neste estado, mantêm vida inativa (latente = hibernação), para sobreviver à intempéries da natureza, como estiagem, congelamento,... Esta capacidade dos micro-organismos se chama de "esporulação", o seu sentido verdadeiro, para se chamar de "esporos".

Hifas ou micélios, na verdade não são "esporos", à pesar de uma grande maioria das pessoas, os chamarem de "esporos", também.

_______________________________________________

Exemplo de esporo em hifa = células unidas umas as outras formando fios.
Conjunto de hifas se chama micélio. Maioria dos cogumelos tem micélios (colônia de hifas) de coloração esbranquiçada.
Alguns em tons levemente acizentadas ou cor-creme, e alguma azul-negras.
Veja,nesta foto, uma célula menor, à solta no canto superior, que é um "esporo verdadeiro" deste cogumelo, capaz de desidratar-se e hibernar, e ainda de ser trasportada ao vento ou uma enxurrada, ou nas patas de algum inseto ou animal, para reproduzir-se em local mais distante.
Esta foto é esporo em hifas do "Helvella acetabulum". Imagem copiada da internet.

__________________________________________

Este é exemplo com spawn para fazer surgimento de hifas brancas, à partir dos esporos globulares de cogumelos. Este é exemplo do esporo de Hiratake-salmão. Ficou muito encharcado no fundo, por alguns erros no preparo do composto, mas funcionou, mesmo assim. Note uma colônia de hifas brancas, surgindo na parede da lata, à esquerda (parecendo um chumaço pequeno de algodão. No fundo da lata há enorme quantidade de esporos globulares do cogumelo (branco-pardo-leitoso). Na parede da lata, à direita, avermelhada é modificação da cor do próprio esporo do cogumelo ( normal), quando sofre estresse (um pouco de desidratação ou contato com ar). Normalmente esporo globular nessa espécie é cor igual às outras (clara e parda quando globulares e quando em hifas são bem brancas).

Desta hifa branca que surgiu é só pegar um pedacinho dela co arame flambado e inocular em gel?ágar em nenhum tipo de glicídio à mais, além do que a própria batata contém (se usar batatas). Máximo que pode acrescentar é algo com mais peptídeos como caldo de soja, feijão ou carne,...

_________________________________________________

Esta imagem é de uma cultura de Shiitaque em 7º dia de incubação.

Semeada na mesma data do hiratake-salmão da imagem acima.

_________________________________________

Algo que é útil, quando as colônias são globulares, é que facilita em muito, diluí-lo em água estéril ou soro fisiológico, aspirar numa seringa, e injetar esporos, para semear substratos de Spawn(substrato semente) ou já em substratos definitivos (substratos preparados em sacos plásticos). Assim, não precisará abrir um buraco maior no saco, para semear(inocular), bastando injetar com seringa e fechar buraquinho com fita adesiva, evitando assim, a entrada de contaminantes.
Quando são esporos hifas(micélios), entope agulha da seringa dificulta operação, a sorte é que em cada ponta dessas hifas soltam esporos globulares também e é nelas o objetivo da lavagem=dissolução de esporos, para injetar em sacos de compostos.

Obs.: É claro se o cultivo iniciar com esporos hifas, velocidade do crescimento é muito maior e abrevia o tempo para cultivo, em muito.