Preparo de esporo seco, para viagem, à partir de cultivo em ágar/gel

Como preparar esporos secos e viáveis para cultivo, à partir das hifas brancas , ou cultura células globulares de cogumelos, ou dos compostos de pinagem de cogumelos, ou da tora de madeira de cultivo de cogumelos.

Material para preparar:
-Recortes de papel absorvente(papel toalha ou papel filtro), em quadradinhos ou retângulos de + ou – 0,5 cm x 0,5 cm, se for de papel higiênico ou lenço de papel, faça tiras um pouco maior e vá dobrando até formar um quadradinho.
-Recorte de papel sulfite (ou papel crepe-pardo), 6 cm x 8 cm)

Modo de preparo:
Dobre o 2 º(papel de 6 x 8 cm) ao meio do comprimento, e coloque o 1º(papel absorvente 0,5 x 0,5 cm ) no meio. Faça dobras nas laterais, fechando aberturas, 1 ou 2 vezes, para fazer um envelopinho que será levado para esterilização.

Faça vários destes envelopinhos, junte tudo e faça um pacote, enrolando tudo num só pacote, em papel Kraft(pardo).
Leve-o para esterilizar em autoclave ou panela de pressão(15min chiando é suficiente,e não 30 min. Como em materiais hospitalares), (porque aqui não tem contato com sangue com possibilidades do vírus da hepatite B, que é bem resistente ao calor).

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Recorte pequenos de papel higiênico, papel toalha ou papel filtro.

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Coloque dentro de envelopinhos de papel, feito com recortes de papel sulfite ou papel kraft(pardo).

Pode ser folha de alumínio.

E leve para esterilização.

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Observação:
No micro-ondas, este não dá. Porque não tem como humidificar, sem encharcar e sem contaminar, e dar pressão de 2 atmosferas, com temperatura de 120 ºC.
E à seco, incendeia o papel, ou fica todo torrado e preto. Micro-ondas é para pasteurização e precisa, ficar aquecendo de 80 ºC à 100ºC por uma hora inteira ou mais, dependendo do volume.
Só em vidros ou (plásticos que agüentem 145ºC = polipropileno) e com conteúdo líquido dentro.
Teria que se fazer, testes se está funcionado pasteurização.



Após ter esterilizado, manipule tudo com técnica asséptica (bancada ou capela de vidro com chama acesa,de bico de Bunzen ou lamparina de querosene, etc, ...
Pegando uma amostra de cultivo de esporos (hifas/micélio ou colônias de células globulares) de frasco, tubo, Placa de petry, etc...
Deixe desdobrado as rebarbas do envelopinho, mas não abra ainda. Deixe perto da lamparina acesa, para evitar conaminação.

Flambe de leve um arame inoculador (espere esfriar, com ela na mão----uns 20 segundos), pegue um pouco dos esporos( em hifa ou colônia de globulares) com a ponta do arame flambado, e abra o envelopinho esterilizado, e inocule no papelotinho absorvente. E feche o envelopinho, imediatamente, o quanto antes, para evitar cair algum pó com contaminante.
Se ficar mancha de fuligem no papelotinho absorvente não faz mal.
Escreva nome do cogumelo e data da inoculação, por fora, pode ser à caneta esferográfica comum.
Ponha num recipiente como pote de vidro ou plástico p/ sobremesa ou copo pequeno(aberto) e leve para um lugar bem seco, e à sombra(sem sol direto), para secar devagar, e muito bem.
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As células somáticas esporulam, se desidratam e entram em hibernação. Hifas em si, morrem, mas na ponta de cada uma das hifas (pelinho) nascem sempre um ou dois esporos soltos, de célula somática e não gameta. (célula globular somática, com potência para se esporular). Olhando um “esporo verdadeiro” de célula somática, no microscópio, ele parece uma célula muito menor, que normal, por não ter quase nada de água no seu citoplasma.
Um esporo que sai das lamelas, dos carimbos, são células gametas. Têm só metade dos cromossomos. Tem masculinos e femeninos no mesmo cogumelo, mas o objetivo deles é voar no vento, encontrar outro esporo gameta e formar um novo embrião (início de novas células-filhos e não clones). Se unir gametas do mesmo cogumelo, para servir de pai e mãe ao mesmo tempo, é quase como clonagem, mas eles vivem normal, mesmo assim, sem problemas.
Um esporo de célula-gameta, dos carimbos é ainda menor (metade do tamanho de um esporo de uma célula somática).

Tem algumas espécies de cogumelos que se bi-esporulam. Ou seja, tem duas células desidratadas, dentro de uma mesma membrana celular. E seu tamanho, então, é duas vezes maior que esporo somático, em geral. Isso quer dizer também 4 vezes maior que um esporo-gameta.
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Se for secar em cima de um lugar levemente aquecida como estufa, ou atrás da geladeira das antigas, seria bom. Deixe secando por 24 à 48 horas, e depois é só colocar em saquinhos de plástico individual, como saquinho para talheres de restaurantes, é suficiente. Assim, pode juntar vários amostras, de vários tipos de cogumelos, enrolar tudo num único pacote de jornal velho(2 folhas bem secas), depois num saco plástico grande(3 L), e fechar bem torcendo as sobras do saco e dando nó depois.
E assim, pode guardar na geladeira por 1 ano (alguns vivem assim por 5 anos) mas prefiro validar para 6 meses, só por garantia.
Tem que ser no último andar de estrados, de baixo, da geladeira, e bem no fundo.

Desse modo, posso manter um banco permanente de esporos, além do “carimbo”.
E com para carimbo, teria que ter cogumelos adultos e bem frescos, com mínimo de contaminação possível.
Essa técnica, de envelopinhos de papel é bem mais segura contra contaminação, e mais fácil de obter amostras para inoculação.
E também, pode-se obter dezenas de envelopinhos inoculados, de um só frasco de cultura, e bem rápido.

O envelopinho pode até ser de folha de alumínio, mas o processo de secá-lo leva mais tempo.


Como extrair esporo de cogumelo da tora de madeira:
Se não tiver cultivos em gel, até pode tirar hifas de onde estão nascendo cogumelos (composto ou fundo da madeira).
É só remover a parte externa da madeira, após ter flambado tora de leve com um maçarico ou fogareirinho de gás (liquinho), e raspando com um canivete, pré-flambado também.
Removendo cerca 1cm de espessura, do local de onde será coletado esporo(hifas-intra madeira), + ou – uma área de 6 a 8 cm de diâmetro é suficiente.
Após essa limpeza, flambe novamente tanto canivete, quanto tora, levemente (máximo 3 segundos) e raspe mais um pouco e jogue fora. Agora próximas lasquinhas, recolha bem pouco para envelopinho, ou direto para Placas de Petry, com gel/substrato de cultivo esterilizado, previamente.
Assim estará clonando este cogumelo.

Como extrair do composto(bolo de substrato orgânico moído):
Do composto em bolo, também é parecido, remover esporos, só um pouco mais fácil.
Entre raspar madeira e raspar composto, qual exige mais esforço físico?
Escolha o bolo mais branco e uniforme possível.
No bolo- composto de onde estão nascendo cogumelos, pegue uma colher prévimente flambada e remova cerca de 1 a 2cm de espessura da parte superior, onde parece, mais branco cheio de hifas(micélio).
Se tiver pins novos nascendo, não precisa, mexer perto delas.
Vire o composto de cabeça para baixo e veja se ele não se desmancha. Se desmanchar, pegue outro mais firme. Flambe de leve em chama, de fogareirinho de liquinho, ou passe maçarico de gás, por cima, de leve, só no canto que vai mexer. Não flambe os pins, nem perto delas.
Flambe também uma colher ou canivete, e raspe mais um pouco, depois com pedacinhos dessas raspas, inocule cultura em gel,ou envelopinho com papelotinhos.
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Seria bom fazer todo esse procedimentro, dentro de uma sala sem corrente de ar, sem ventilador ou dentro de uma capela de vidro, para manipulação biológica, onde entra só as mãos para dentro, e os objetos de que vai manipular.
No período que está desocupado, manteria uma lâmpada de “LUZ-NEGRA”(=ultra violeta, para esterilizar o ar e superfície interna. Enquanto ela estiver ligada, tem que manter um cobertor(pode ser de pano de brim cor escura), cobrindo a capelinha.
Ponde ser também aquela “manta=refletora”, que se usa em construção de casas.(Aquela que é colocando antes das telhas, como isolante térmico e anti-goteiras).
Remover cobertor e desligar a lâmpada de Luz-negra, quando quiser dar trabalhos nela (capela de vidro).
Deixar ligado 2 ou 3 horas, antes de começar a manipular, matérias biológicos, evita contaminação nos meios de cultura.
É claro que não deve deixar de lado, todas as outras precauções de manuseio biológico, contra contaminações dos meios (gel/ágar) para culturas.
Enquanto a luz negra estiver ligada, use óculos escuro para olhar, ou desligue quanto antes. Não deixe crianças, ficar olhando para luz-negra, à menos de 2 ou3 metros de distância, que vai acabar ficando com catarata antes da idade, ou ter envelhecimento precoce da retina do olho( células do fundo do olho).


Com este método de guardar esporos, é bem prático para enviar pelo Correios, dentro de uma carta normal e não precisa ser SEDEX.
Pode agüentar perfeitamente, temperatura ambiente por algumas semanas, sem perder vitalidade, de se vegetar novamente, quando papelotinho ser inserido diretamente, sobre um gel/ágar para cultura de esporos de cogumelos. Não precisa raspar nada, para semear gel.
Só precisa uma pinça anatômica, de ponta fina, sem dente.
Flambar a ponta, dessa pinça, esperar segurando na mão uns 30 segundos para esfriar, e pegar papelotinho, e colocar no gel/ágar para cultivar na incubadora, entre 31ºC à 38ºC.

Detalhes:
Se o gel de cultura contiver mais açúcar/glicose, em vez de hifas irão tender a formar mais colônias de células globulares, porque eles se acomodam.
As hifas são uma medida de sobrevivência, desses seres, onde eles ou tentam buscar por comida, mais longe, de onde está, ou tentam dar mais filhos ao mundo, como sobrevivência da espécie, frutificando e maturando gametas para lançá-los ao vento, para que seus filhos possam buscar paradas e oportunidades de sobreviver, fora do local onde atual (os pais) estão. E dizem que, porque um único cogumelo pode dar gametas machos e fêmeas ao mesmo tempo. E porque não têm diferenças sexuais verdadeiras, como nos animais superiores. Onde o sexo seria determinado por diferenças cromossômicas, exatas

Resultado de cultura, guardada em evelopinho com papelote seco, em geladeira (porta) por 4 meses.

Esse da foto é de um esporo do gênero pleurotus. E creceu células em formato globuloso(placas pardo leitoso) (= células soltas uma da outra e não em hifas). Neste formato é mais fácil de diluir em água para inocular com seringas, depois.

Se quizer que cresça em hifas é só reduzir(ou não colocar) glicídios(açúcares: glucose, dextrose, melaço,....) quando preparar ágar/gel.

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Envelopinhos guardado dentro de pote fechado com sachê de desecante (sais de cálcio ou potássio), para manter bem seco, os esporos e prolongar vida útil.

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Este sachê de desecante veio junto em pacote de alga comestível para sushi (nori---= produto japonesa) e estou reaproveitando.

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Guardar os envelopinhos, pós esterelizados, também em local seco, antes de inocular.

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Inoculando papelote.

Com ponta de um arame flambado, pegue uma pequena quantidade de hifas, ou megulhe na gosma(placa leitosa parda) de esporos de cogumelo e encoste no papelote e feche imediatamente, para não cair pó de contaminação, invisível.

Leve o papelote para secar, em cima de local aquecido como em cima da incubadora, por 24 horas.

Guarde depois em pote bem fechado, com sachê de dessecante químico.